[일반시험법]박층크로마토그래프법(Thin Layer Chromatography)

박층크로마토그래프법은 적당한 고정상으로 만든 박층(薄層, 얇은 층)을 써서 혼합물을 이동상으로 전개하여 각각의 성분으로 분리하는 방법이며 물질의 확인 또는 순도시험 등에 쓴다.

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박층판의 조제 = 보통 다음 방법에 따른다.

5 cm × 20 cm 또는 20 cm × 20 cm의 평활하고 두께가 고른 유리판을 써서 그 한 면에 의약품각조에서 규정하는 고정상 고체의 가루를 물에 현탁한 액을 적당한 기구를 써서 0.2 ~ 0.3 mm의 두께로 고르게 도포한다. 바람에 말린 다음 105 ~ 120 ℃ 사이의 일정한 온도에서 30 ~ 60 분간 가열건조하여 박층판을 만든다. 유리판 대신 적당한 플라스틱판을 쓸 수 있다. 박층판은 습기를 피하여 보존한다.

 

실제 현업에서는 박층판을 조제하지 않고 구매하여 사용한다.  (Merck millipore, Supelco 등)
선택사항 : 10 cm x 10 cm, 20 cm x 10 cm. 20 cm x 20 cm 등 다양한 크기, 도포된 재질(Silica, Cellulose 등)
일반 TLC or HP(High Performance)TLC, 형광발색제(F254) 도포유무, Concentration zone 유무 등등

 

조 작 법 = 따로 규정이 없는 한 다음 방법에 따른다.

박층판의 아래끝에서 약 20 mm 높이의 위치를 원선으로 하고 좌우 양측에서 적어도 10 mm를 띄어서 원선 위에 의약품각조에서 규정하는 양의 검액 및 표준액을 마이크로피펫 등을 써서 약 10 mm 이상의 적당한 간격으로 지름 2 ~ 6 mm의 원형상으로 점적하고 바람에 말린다. 다음에 따로 규정이 없는 한 미리 전개조의 안쪽 벽을 따라 여지를 두르고 여지를 전개용매로 적시고 다시 전개용매를 약 10 mm의 깊이로 넣어 전개조를 밀폐하여 상온에서 약 1 시간 방치하고 여기에 박층판을 기벽에 닿지 않도록 넣고 전개조를 밀폐하여 상온에서 전개한다. 전개용매의 선단이 원선으로부터 의약품각조에서 규정하는 거리까지 전개하였을 때 박층판을 꺼내어 곧 용매의 선단 위치를 표시하고 바람에 말린 다음 의약품각조에서 규정하는 방법에 따라 검액 및 표준액의 각 반점의 Rf 값, 색 등을 비교한다. 다음 식에 따라 Rf 값을 구한다.

Rf = 원선에서 반점의 중심까지의 거리 / 원선에서 용매선단까지의 거리

원선 = 아래 그림에서 Base Line,  즉 용매가 전개되는 시작점
용매선단 = 아래 그림에서 Solvent front, 용매가 전개되는 끝점 을 의미한다.

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박층크로마토그래피는 일반적으로 Monograph에서 정해진 시험법대로 진행하며, 시험법을 수정하거나 특정 물질을 분리하기 위해서 Method를 새로 설정하고자 한다면 논문 및 자료를 참고하여 이동상 용매의 성분비를 변경하거나 pH를 조절하여 분리하고자 하는 물질의 Rf값을 조절하여 분리할 수 있다.

Plate의 경우 일반적으로 유리로 된 glass plate를 사용하나 plastic plate 또는 얇은 알루미늄으로 된 plate도 있으며 plate에 도포되어있는 Silica 종류는 LC(액체크로마토그래피)에서 사용하는 컬럼 내 Silica 종류처럼 C18, C8도 있고 Cellulose 등 다양한 종류가 있다.

최종 확인하고자 하는 물질이 형광물질로 확인하는 경우 Plate에 발색물질(F254)이 도포된 plate를 구매하여 사용할 수 있다. (일반적으로 확인하는 파장대는 254 nm/365 nm)

TLC보다 분리도를 높이고 싶다면 Plate의 종류를 HPTLC(High Performance Thin Layer chromatography)재질로 변경하면 분리도를 높일 수 있다. 그리고 검액의 점적을 용이하게 할 수 있도록 concenctration zone이 되어있는 plate도 시험할 수 있다.

최근에는 TLC 점적부터 전개, 발색까지 모두 기기를 사용하여 진행할 수 있으니, 정밀한 시험이 요구되거나 GMP 규정에 따라 Data integrity 절차를 지켜야 할 경우에는 시험기기를 구매하여 진행할 수 있다

CAMAG사 홈페이지 참고

※ 관련 시험법

https://method-of-analysis.tistory.com/37

[유럽약전]Ph.Eur 2.2.27 Thin layer chromatography[박층크로마토그래피-번역]

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