자외가시부흡광도측정법은 보통 파장 200 ~ 800 nm의 빛이 물질에 의해 흡수되는 정도를 측정하여 물질의 확인시험, 순도시험, 정량 등을 할 수 있는 방법이다. 다만 원자흡광광도계를 쓰는 방법은 따로 규정한다.
단색광이 어떤 물질의 용액을 통과할 때 투과광의 강도 P의 입사광의 강도 P0에 대한 비율을 투과도 t라 하며 이것을 백분율로 표시한 것을 투과율 T라 한다. 또 투과도의 역수의 상용대수를 흡광도 A라 한다.
t (투과도) = P (투과광의 강도) / P0 (입사광의 강도)
T (투과율) = P/P0 ×100 = t × 100
A (흡광도) = log P0/P
흡광도 A는 용액의 농도 c (concentration) 및 층장 l (length)에 비례한다.
A = k × c × l (k는 흡광계수)
l을 1 cm, c 를 흡광물질의 농도 1 mol/L의 용액으로 환산하였을 때의 흡광도를 몰흡광계수 e이라 한다. 흡수극대파장에서의 몰흡광계수는 e max로 표시한다.
물질의 용액에 빛을 통할 때 흡광도는 그 빛의 파장에 따라 다르다. 따라서 파장을 조금씩 변화시킨 빛에 대하여 흡광도를 측정하여 이를 파장과의 관계를 나타내는 곡선을 그려 자외가시부흡수스펙트럼(이하 흡수스펙트럼)을 얻는다. 이 흡수스펙트럼에서 그 물질의 흡수극대파장 (λmax) 및 흡수극소파장 (λmin)을 알 수 있다. 또 흡수스펙트럼은 그 물질의 화학구조에 의하여 정해지므로 특정 파장범위의 흡수스펙트럼을 측정하여 표준품의 흡수스펙트럼과 비교하거나 흡수극대파장을 측정하거나, 특정한 두 파장에서의 흡광도의 비를 측정하는 방법 등으로 물질을 확인할 수 있다. 또한 흡수의 극대파장 또는 극소파장을 측정하거나 특정한 두 파장에서의 흡광도비를 측정하여 확인 또는 순도시험을 한다. 또한 흡수극대파장에서의 일정농도의 용액 등의 흡광도를 측정하고 일정 농도의 표준액 등의 흡광도와 비교하여 정량을 할 수 있다.
장치 및 조정법
측정장치로는 분광광도계 또는 광전광도계를 쓴다. 미리 분광광도계 또는 광전광도계에 첨부된 조작방법에 따라 장치를 조정하여 파장 및 투과율이 아래의 시험법에 적합한가를 확인한다.
파장은 파장교정용 광학필터를 써서 각각의 필터에 첨부된 시험성적서의 시험조건으로 시험성적서에 표시된 기준값의 파장부근에서의 투과율을 측정하고 투과율이 극소값을 나타내는 파장을 읽는 시험을 할 때 그 측정파장과 기준값 파장과의 편차는 ± 0.5 nm 이내이고, 측정을 3 회 반복할 때 측정값은 모두 평균값 ± 0.2 nm 이내이다. 또 저압수은램프의 253.65 nm, 365.02 nm, 435.84 nm, 546.07 nm 또는 중수소방전관의 486.00 nm, 656.10 nm의 휘선을 써서 시험할 수 있다. 이 때의 측정파장과 휘선의 파장과의 편차는 ± 0.3 nm 이내이고 측정을 3 회 반복할 때 측정값은 모두 평균값 ± 0.2 nm 이내이다.
투과율 또는 흡광도는 투과율교정용 광학필터를 써서 각각의 필터에 첨부된 시험성적서의 시험조건으로 시험성적서에 표시된 기준값의 파장에서의 투과율을 읽는 시험을 할 때 그 측정투과율과 기준투과율과의 편차는 시험성적서에 표시된 상대정밀도의 상한값 및 하한값에 각각 1 %를 더한 값 이내이고 측정을 3 회 반복할 때 흡광도의 측정값 (또는 투과율의 측정값을 흡광도로 환산한 값)은 흡광도가 0.500 이하일 때 모두 평균값 ± 0.002 이내이고, 흡광도가 0.500를 넘을 때는 모두 평균값 ± 0.004 이내이다. 또한 동일파장에서 투과율이 다른 여러 장의 투과율교정용 광학필터를 써서 투과율의 직선성을 확인하는 것이 바람직하다.
조 작 법
미리 장치 및 조정법 항에서 규정하는 방법에 따라 조정한 장치를 써서 광원, 검출기, 장치의 측정모드, 측정파장 또는 측정파장범위, 스펙트럼 폭, 파장주사속도 등을 선택하여 설정한다. 장치를 작동시켜 일정 시간 방치하고 장치가 안정되게 작동하는가를 확인한다. 다음에 보통 검체광로의 셔터를 닫아 광을 차단하고 측정파장 또는 측정파장범위에서의 투과율의 지시값이 0 %가 되도록 조정한다(Zero 맞추기). 다시 셔터를 열고 측정파장 또는 측정파장범위의 투과율의 지시값이 100 % (또는 흡광도가 0)가 되도록 조정한다. 대조액을 넣은 셀을 광로에 넣는다. 보통 대조액을 넣은 셀을 검체광로 및 대조광로에 놓고 투과율의 지시값을 100 % (또는 흡광도가 0)로 조정한다. 대조액으로는 따로 규정이 없는 한 시험에 쓴 용매를 쓴다. 다음에 측정하고자 하는 용액을 넣은 셀을 검체광로에 넣고 측정파장에서의 흡광도 또는 측정파장범위에서 흡수스펙트럼을 측정한다. 또한 자외부 흡수측정에는 석영으로 만든 셀을 쓰고, 가시부 흡수측정에는 유리 또는 석영으로 만든 셀을 쓰고, 따로 규정이 없는 한 층장은 1 cm(빛이 통과하는 셀의 두께, 크기)로 한다. 또 자외부의 흡수측정에 쓰는 용매의 흡수에 대하여는 특별히 고려하여 측정을 방해하지 않는 것을 쓴다.
비흡광도
l을 1 cm, c를 약품의 농도 1 w/v%의 용액으로 환산하였을 때의 흡광도를 비흡광도(E)라고 하며 아래와 같이 표시한다.
E = A / (c × l)
l : 층장 (cm), A : 흡광도, c : 용액의 농도 (w/v%)
예를 들면 의약품각조에서 E (241 nm) : 500 ~ 530 (건조 후, 2 mg, 메탄올, 200 mL)이라고 규정하는 것은 이 약을 건조감량의 항에서 규정하는 조건으로 건조하여 약 2 mg을 정밀저울을 써서 정밀하게 달아 메탄올을 넣어 녹이고 메탄올로 정확하게 200 mL로 한 다음 이 액에 대하여 층장 1 cm, 파장 241 nm에서의 흡광도를 조작법에 규정하는 방법으로 측정할 때 E가 500 ~ 530인 것을 나타낸다.
확인시험
의약품각조에서 규정하는 방법으로 검액을 만들고 조작법에서 규정하는 방법으로 시험한다. 검액에서 얻은 흡광도 또는 흡수스펙트럼을 써서 보통 다음의 방법을 단독 또는 조합한 방법으로 확인한다. 다만 장치의 기종 차에 의해 생긴다고 추정되는 스펙트럼의 매우 작은 차이는 무시할 수 있는 것으로 한다.
1) 표준품에 의한 확인
검체의 흡수스펙트럼과 표준품의 흡수스펙트럼을 비교하여 스펙트럼이 같은 파장에서 같은 강도의 흡수를 나타낼 때 검체가 표준품과 같은 물질임을 확인한다.
2) 흡수파장에 의한 확인
검체의 흡수스펙트럼의 흡수극대파장이 의약품각조에서 규정하는 흡수극대파장의 범위인가를 확인하여 검체의 흡수극대파장이 의약품각조의 규정에 맞을 때 검체가 의약품각조 의약품과 같은 물질임을 확인된다.
3) 흡광도 비(Ratio)에 의한 확인
검체의 흡수스펙트럼의 둘 이상의 파장에서 흡광도비를 구하고 의약품각조에서 규정하는 흡광도비와 비교하여 검체의 흡광도비가 의약품각조의 규정에 맞을 때 검체가 의약품각조 의약품과 같은 물질임을 확인된다.
정 량 법
의약품각조에서 규정하는 방법으로 대조액, 검액 및 표준액을 만들고 조작법에 따라 시험하여 검액 및 표준액의 흡광도를 측정하고 서로의 흡광도를 비교하여 정량한다. 또한 대조액과 검액을 가지고 흡광도를 측정하여 의약품각조에 규정하는 식으로 정량할 수 있다.
자외가시부흡광도측정법은 시험실에서 간단하면서도 유용하게 사용되는 시험법으로 사용범위도 확인시험부터 함량시험, 유연물질시험까지 다양한 방면에서 적용가능하다.
단파장(Single), 듀얼(Dual)파장 분석 또는 Spectrum으로 분석 등 여러 방법을 통해 표준품과 검체를 비교하거나 또는 흡수극대, 흡수극소 등의 물질 특성을 이용하여 분석한다.
흔히 사용하는 HPLC의 검출기(detector)도 보통 UV-Vis 을 사용하므로 HPLC가 컬럼을 이용하여 검체의 유지시간에 따라 원하는 분석물질을 분리한다는 것을 제외하고는 동일한 원리라고 볼 수 있다.
분석기기 관련 소모품은 램프(Lamp)나 셀(UV Cell) 교체 이외엔 특별히 없으며, 일반적으로 PC와 연결하여 사용하나 PC 없이 자체적으로 모니터(터치형)를 가지고 있는 UV-Vis 제품들도 있어 찾아보면 다양한 제품을 확인할 수 있을 것이다.
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