박층 크로마토그래피는 유리, 금속 또는 플라스틱의 지지체(판) 위에 적절한 물질로 구성된 고정상을 균일한 얇은 층으로 펴서 분리하는 기술입니다. 분석물의 용액은 전개하기 전에 고정상 Plate에 증착(蒸着, 얇은 막으로 입히다)됩니다. 분리는 흡착, 분배, 이온 교환 또는 이러한 메커니즘의 조합을 기반으로 하며 얇은 층(고정상)을 통해 용매 또는 적절한 용매 혼합물(이동상)에서 용질(분석물 용액)의 이동(전개)에 의해 수행됩니다.
기구(Apparatus)
얇은 판(Plate, 이하 플레이트). 크로마토그래피는 Reagent(4.1.1)에 설명된 대로 사전에 코팅된 플레이트를 사용하여 수행됩니다. 실리카겔의 입자크기는 사용하는 시험에서 시약명 뒤에 표기된다.
얇은 판의 전처리. 분리하기 전에 플레이트를 세척해야 할 수 있으며 적절한 용매의 이동에 의해 수행될 수 있습니다. 플레이트는 현상, 침지 또는 분무와 같은 절차에 의해 함침될 수도 있습니다. 사용 시 필요한 경우 120°C의 오븐에서 20분 동안 가열하여 플레이트를 활성화할 수 있습니다.
평평한 바닥 또는 트윈 트로프(twin trough, 쌍둥이 골)가 있는 크로마토그래피 탱크(전개조)는 불활성의 투명한 재료로 사용되는 플레이트에 적합한 크기이며 꼭 맞는 뚜껑이 제공됩니다. 수평 개발을 위해 탱크에는 이동상용 트로프가 제공되며 이동상을 고정상으로 안내하는 장치가 추가로 포함됩니다.
Micropipettes, microsyringes, 교정된 일회용 모세관 또는 솔루션의 적절한 적용에 적합한 기타 적용 장치.
직접 형광 또는 형광 억제를 측정하는 형광 검출 장치.
시각화 장치 및 시약. 분무, 침지 또는 증기 노출을 통해 플레이트 시약으로 이동하기 위한 유도체화에 적합한 장치가 사용되며, 해당되는 경우 분리된 구성 요소의 시각화를 위한 가열을 용이하게 합니다.
문서화. 분석장치는 예를 들어 사진 또는 컴퓨터 파일과 같은 시각화된 크로마토그램의 문서화를 제공하는 데 사용될 수 있습니다.
방법(Method)
샘플 점적. 아래쪽 가장자리와 판의 측면에서 적당한 거리를 두고 아래쪽 가장자리와 평행한 선에 정해진 양의 용액을 점적합니다. 원형 반점의 중심 사이에 최소 10mm(고성능 플레이트의 경우 5mm), 밴드 가장자리 사이에 5mm(고성능 플레이트의 경우 2mm)의 간격을 허용합니다. 용액을 충분히 작은 부분으로 적용하여 직경 2-5mm(고성능 플레이트의 경우 1-2mm) 또는 밴드 10-20mm(고성능 플레이트의 경우 5-10mm) x 1-2mm의 원형 반점을 얻습니다.
일반판과 고성능판을 모두 사용할 수 있는 모노그래프에서 고성능판의 작업조건은 일반판의 작업조건 다음에 괄호 [ ] 안에 기재한다.
수직 전개. 여과지로 크로마토그래피 전개조의 벽을 정렬합니다. 여과지를 함침시킨 후 사용할 플레이트의 치수와 관련된 적절한 깊이의 층을 제공할 수 있도록 전개조 크기에 대해 충분한 양의 이동상을 크로마토그래피 전개조에 붓습니다. 크로마토그래피 전개조의 포화를 위해 뚜껑을 교체하고 20-25°C에서 1시간 동안 방치합니다. 모노그래프에 달리 명시되지 않는 한 크로마토그래피 분리는 포화된 전개조에서 수행됩니다. 위에서 설명한 대로 정해진 양의 용액을 적용니다. 적용된 용액에서 용매가 증발하면 플레이트를 크로마토그래피 전개조에 놓고 플레이트가 가능한 한 수직이고 반점 또는 밴드가 이동상의 표면 위에 있는지 확인합니다. 크로마토그래피 전개조 뚜껑을 닫고 20-25°C에서 유지하고 햇빛으로부터 보호합니다. 적용 지점과 용매 전면 사이에서 측정하여 이동상이 규정된 거리 이상 이동하면 플레이트를 제거합니다. 플레이트를 건조시키고 규정된 대로 크로마토그램을 시각화합니다.
2차원 크로마토그래피의 경우 1차 현상 후 플레이트를 건조시키고 1차 현상 방향과 수직인 방향으로 2차 현상을 수행합니다.
수평 전개. 위에서 설명한 대로 용액의 규정된 양을 적용합니다. 적용된 용액에서 용매가 증발되면 주사기 또는 피펫을 사용하여 충분한 양의 이동상을 전개조의 트로프(trough)에 도입하고 수평인지 확인한 후 플레이트를 전개조에 넣고 제조업체의 지침에 따라 이동상 방향 장치를 연결합니다. 규정된 경우 양쪽 끝에서 동시에 시작하여 플레이트를 전개합니다. 전개조 뚜껑을 닫고 20-25°C에서 유지합니다. 이동상이 모노그래프에 규정된 거리 이상 이동하면 플레이트를 제거합니다. 플레이트를 건조시키고 규정된 대로 크로마토그램을 시각화합니다.
2차원 크로마토그래피의 경우 1차 현상 후 플레이트를 건조시키고 1차 현상 방향과 수직인 방향으로 2차 현상을 수행합니다.
시각적 평가(Visual evaluation)
확인. 시험용액으로 얻은 크로마토그램의 주요 반점은 두 반점의 색, 크기 및 지연계수(RF)를 비교하여 대조용액으로 얻은 크로마토그램의 해당 반점과 시각적으로 비교합니다.
지연 계수(RF)는 적용 지점(시작점)에서 스폿(Spot)중심까지의 거리와 적용 지점(시작점)에서 용매가 이동한 거리의 비율로 정의됩니다.
식별을 위한 분리력 확인. 일반적으로 시약(4.1.1)에 설명된 적합성 시험에 의해 주어진 성능이면 충분합니다. 특별한 경우에만 추가 성능 기준이 모노그래프에 규정되어 있습니다.
유연 물질(Related substance) 시험. 시험 용액으로 얻은 크로마토그램의 2차 반점은 불순물을 포함하는 기준 용액으로 얻은 크로마토그램의 해당 반점 또는 시험용액의 희석액으로 조제된 참조용액에서 얻은 크로마토그램의 반점과 시각적으로 비교합니다.
분리력 확인. 분리력 검증에 대한 요구 사항은 해당 모노그래프에 규정되어 있습니다.
검출력 검증. 가장 묽은 기준액으로 얻은 크로마토그램에서 반점이나 띠가 선명하게 보이면 검출력이 만족스러운 것입니다.
정량적 측정(Quantitative measurement)
해결 및 분리에 대한 요구 사항은 해당 모노그래프에 규정되어 있습니다.
박층크로마토그래피로 분리되고 UV-Vis 조사에 반응하는 물질은 적절한 기기를 사용하여 플레이트에서 직접 측정할 수 있습니다. 판이나 측정기를 이동시키면서 입사광의 반사율을 측정하여 판을 검사합니다. 이와 유사하게, 형광은 적절한 광학 시스템을 사용하여 측정할 수 있습다. 방사성핵종을 포함하는 물질은 다음과 같은 3가지 방법으로 정량화할 수 있습니다.
1)플레이트를 적절한 카운터 옆으로 직접 이동하거나 그 반대의 경우(방사성 의약품 제제(0125) 참조),
2)플레이트를 스트립으로 절단하고 적절한 카운터를 사용하여 각 개별 스트립의 방사능을 측정
3)고정상을 긁어내어 적절한 섬광 칵테일에 용해하고 액체 섬광 계수기를 사용하여 방사능을 측정
기구. 플레이트의 직접 측정 장치는 다음으로 구성됩니다.
- 플레이트에 물질의 양을 정확하게 배치하고 재현 가능한 분배를 위한 장치;
- x-축 또는 y-축을 따라 플레이트 또는 측정 장치를 이동시키는 기계적 장치;
– 녹음기 및 적절한 통합자 또는 컴퓨터
-UV-Vis 조사에 반응하는 물질의 경우: 광원이 있는 광도계, 단색광을 생성할 수 있는 광학 장치 및 적절한 감도의 광전지는 반사율 또는 투과율 측정에 사용됩니다. 형광이 측정되는 경우 여기를 위해 사용된 빛이 검출기에 도달하는 것을 방지하고 방출된 빛 또는 그 특정 부분은 통과하도록 적절한 필터가 필요합니다.
– 방사성핵종을 포함하는 물질의 경우: 방사능에 대한 적절한 카운터. 계수 장치의 선형성 범위를 확인해야 합니다.
방법. 시험물질의 용액(시험용액)은 각조의 규정에 따라 조제하고, 필요에 따라 시험용액과 동일한 용매를 사용하여 측정물질의 표준용액을 조제한다. 동일한 부피의 각 용액을 플레이트에 적용하고 현상합니다.
UV-Vis 조사에 반응하는 물질. 검사할 물질의 3개 이상의 참조 용액을 준비하고 적용하며, 농도는 시험 용액의 예상 값(약 80%, 100% 및 120%)에 걸쳐 있습니다. 필요한 경우 지정된된 시약으로 처리하고 시험용액과 대조용액으로 얻은 크로마토그램의 반사율, 투과율 또는 형광도를 기록한다. 측정된 결과를 시험용액의 물질량 계산에 사용한다.
방사성 핵종을 포함하는 물질. 예상 값의 약 100%를 포함하는 테스트 용액을 준비하고 적용합니다. 경로 길이의 함수로 방사능을 결정하고 각 결과 피크의 방사능을 총 방사능 양의 백분율로 보고합니다.
시스템의 적합성을 평가하기 위한 기준은 크로마토그래피 분리 기술(Chromatorgram separation techniques, 2.2.46) 장에 설명되어 있습니다. 크로마토그래피 시스템의 매개변수를 조정하여 시스템 적합성 기준을 충족할 수 있는 범위도 이 장에 나와 있습니다.
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