[일반시험법]액체크로마토그래프법(HPLC Method)

액체크로마토그래프법(HPLC METHOD)

액체크로마토그래프법은 적당한 고정상을 써서 만든 칼럼에 검체를 주입하고, 이동상을 액체를 사용하여 고정상에 대한 유지력의 차를 이용해 각각의 성분으로 분리하여 분석하는 방법이다.

검체를 액체(용액)로 만들 수 있을 때 적용할 수 있으며, 물질의 확인(Identificaiton), 순도(Purify), 정량(Assay) 시험 등에 사용한다.

HPLC 구성도 예시(출처 : https://www.technologynetworks.com/)

위의 그림 예시에 있는 번호에 따라 설명을 참고할 수 있다.

1. Pump(펌프)는 이동상 및 반응시약을 일정한 유량으로 보낼 수 있으며 이것을 조절하는 이동상조성제어장치는 설정하는 방법에 따라
등용매용리(Isocratic 방식: 일정하게 용매주입)와 농도구배용리(Gradient 방식:서로 다른 용매를 시간에 따라 들어가는 비율을 조절) 방식으로 펌프를 이용하여 이동상 조성을 제어할 수 있다.

2. Autosampler(검체주입기)는 일정한 양의 검체를 정확하고 재현성 있게 장치에 도입한다.

3. Column(칼럼)은 일정한 크기의 액체크로마토그래프용 충진제를 금속 관에 고르게 충전하거나 충전제 대신 고정상을 관벽에 보유시킨 것을 쓸 수 있다. 오븐(Oven)은 칼럼의 온도를 일정하게 제어할 수 있다.

4. Detector(검출기)는 피검물질의 이동상과는 다른 성질을 검출하는 것으로 일반적으로 자외가시부흡광광도계(UV detector),  형광광도계, 시차굴절계(RI detector), 질량분석계(Mass detector) 등 다양하게 있으며 농도에 비례한 신호를 검출해 낸다.

5. 기록장치는 검출기에 의하여 얻어진 신호의 강도를 화면에 표시하며 기록한다. 크로마토그램(Chromatogram), 유지시간(Retention time), 검체의 함량값 등을 프린터기를 이용하면 출력할 수 있다.

위와 같은 HPLC의 구성을 가지고 다양한 조작조건을 설정하여 원하고자 하는 물질을 분석할 수 있다.

조절가능한 조작조건들 :

칼럼의 안지름(Diameter)과 길이(Length) 및 충진제의 내경(Pore size), 칼럼오븐온도(Oven temp.), 이동상의 조성비(Mobile phase ratio), 이동상의 완충액 조성(Mobile phase buffer), 농도기울기 프로그램(Gredient control), 이동상의 유량(Flow rate)  등이 있다.

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