무기 인산염 측정 시험법(휘스케서바로우시험법, Fiske-Subbarow Method)
인산염을 정량할 수 있는 시험법인 휘스케서바로우 (Fiske-Subbarow Method) 시험법을 알아보자.
1. 정의
Fiske-Subbarow 시험법은 무기 인산(inorganic phosphate, Pi)을 색상계(colorimetric)로 정량하는 시험법으로 Cyrus H. Fiske와 Yellapragada Subbarow가 1925년에 개발했으며, 특히 혈액, 소변, 조직 등에서 인산염을 정량적으로 분석할 때 사용됩니다.
2. 원리 (Principle)
이 방법은 인산염이 암모늄 몰리브데이트(ammonium molybdate)와 반응하여 파란색의 포스포몰리브데이트(phosphomolybdate) 복합체를 생성하는 것을 기반으로 합니다.
이 복합체는 1-아미노-2-나프톨-4-설포닉산(1-amino-2-naphthol-4-sulfonic acid)으로 환원되어 청록색(몰리브덴 블루, molybdenum blue)을 형성하며, 이 색상의 강도는 인산염의 농도에 비례합니다.
3. 반응과정
Step1. 인산염 + 암모늄 몰리브데이트 = 포스포몰리브데이트(인산몰리브데이트) 복합체 형성
Step2. 포스포몰리브데이트 복합체 + 환원제(1-아미노-2-나프톨-4-설포닉산 또는 아스코르브산) = 몰리브덴 블루(molybdenum blue, Mo(V) complex)
Step3. 몰리브덴 블루의 청록색 색상을 색도계나 스펙트로포토미터로 측정
4. 시약 (Reagents)
4.1 몰리브덴산 암모늄 용액 (Ammonium molybdate solution)
- 2.5% (w/v) (NH₄)₂MoO₄ in 5N H₂SO₄
4.2 환원제 (Reducing Agent)
- 아미노나프톨술폰산(Amino-naphthol-sulfonic acid, ANSA) 또는 아스코르브산(Ascorbic acid)
4.3 인산 표준 용액 (Phosphate standard solution)
- KH₂PO₄(인산칼륨) 또는 NaH₂PO₄(인산나트륨) 사용
5. 실험 방법 (Procedure)
5.1 시료 준비
분석할 샘플(혈액, 세포 배양액 등)을 준비
5.2 반응 혼합물 준비
샘플 1mL + 몰리브덴산 암모늄 0.5mL + 환원제 0.5mL 혼합
5.3 반응
37℃ 또는 상온에서 10~30분 동안 방치 (몰리브덴 블루 형성)
5.4 흡광도 측정
660~700nm에서 스펙트로포토미터로 흡광도 측정하여 농도를 계산.
표준 곡선과 비교하여 샘플의 무기 인산 농도(μM~mM 범위) 결정.
6. 응용 (Applications)
6.1 생화학 연구
6.2 ATP 가수분해 효소(ATPase) 및 인산화 반응 연구
6.3 임상 진단
6.4 혈청 내 인산 농도 측정
6.5 신장 질환, 골대사 관련 질환 진단
6.6 미생물 및 식물 연구
6.7 인산 대사 연구
6.8 세포 내 인산 농도 분석
7. 장점 및 단점
✅ 장점
✔ 고감도(Sensitive): μM 수준의 낮은 농도도 검출 가능하고 매우 정확하여 생물학적 연구에서 널리 사용됩니다.
✔ 간단한 방법(Simple): 실험 절차가 비교적 간단합니다
✔ 넓은 적용 범위: 혈액, 조직, 세포 배양액 등 다양한 시료 분석 가능합니다
❌ 단점
✖ 간섭 물질(Interference): 실리카, 아르세네이트, 특정 산 및 염류 등으로 인해 간섭이 발생할 수 있으며 단백질, 지질 등이 반응에 영향을 줄 수 있음
✖ 화학적 폐기물: 강산(H₂SO₄)과 몰리브덴 화합물 사용으로 환경적 고려 필요
8. 수정 및 응용:
여러 연구자들은 이 방법의 간섭 문제를 해결하기 위해 다양한 수정 방법을 제안했습니다. 예를 들어, 바나듐 펜톡사이드를 사용한 시료 소화 과정을 포함하거나, pH 조절을 통해 ATP와 같은 간섭 물질의 영향을 줄이는 방법이 있습니다.
역사적 중요성:
이 방법은 생물학적 연구에서 인산염 측정의 기초를 제공했으며, ATP와 같은 중요한 생물학적 분자의 발견에도 큰 기여를 했습니다.
Fiske-Subbarow 시험법은 생물학, 생화학, 임상 화학 분야에서 인산염의 정량 분석에 있어 중요한 역할을 해왔으며 계속해서 사용되고 있습니다.
해당 내용은 chat gpt 등의 검색을 통해 가져온 자료입니다.